ChIP實(shí)驗(yàn)原理

在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)－DNA復(fù)合物，并將其隨機(jī)切斷為一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過對(duì)目的片斷的純化與檢測(cè)，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。

可以利用ChIP研究轉(zhuǎn)錄因子（ transcription factor, TF）與啟動(dòng)子（promoter）的關(guān)聯(lián)性。由于ChIP采用甲醛固定活細(xì)胞或者組織的方法，所以能比較真實(shí)的反映細(xì)胞內(nèi)TF與Promoter的結(jié)合情況。這個(gè)優(yōu)勢(shì)是EMSA這個(gè)體外研究核酸與蛋白相互結(jié)合的實(shí)驗(yàn)方法所不能比擬的。當(dāng)用甲醛處理時(shí)，相互靠近的蛋白與蛋白，蛋白與核酸（DNA或RNA）之間會(huì)產(chǎn)生共價(jià)鍵。細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)TF與Promoter相互結(jié)合（生物意義上的結(jié)合）時(shí)，它們必然靠的比較近，或者契合在一起，這個(gè)時(shí)候用甲醛處理，能使它們之間產(chǎn)生共價(jià)鍵。

一般ChIP的流程是：甲醛處理細(xì)胞——收集細(xì)胞，超聲破碎——加入目的蛋白的抗體，與靶蛋白-DNA復(fù)合物相互結(jié)合——加入Protein A，結(jié)合抗體-靶蛋白-DNA復(fù)合物，并沉淀——對(duì)沉淀下來的復(fù)合物進(jìn)行清洗，除去一些非特異性結(jié)合——洗脫，得到富集的靶蛋白-DNA復(fù)合物——解交聯(lián)，純化富集的DNA-片斷——PCR分析。

ChIP實(shí)驗(yàn)步驟

第一天：
（一）、細(xì)胞的甲醛交聯(lián)與超聲破碎。
1、取出1平皿細(xì)胞（10cm平皿），加入243ul 37％甲醛，使得甲醛的終濃度為1％。（培養(yǎng)基共有9ml）
2、37攝氏度孵育10min。
3、終止交聯(lián)：加甘氨酸至終濃度為0.125M。
450ul 2.5M甘氨酸于平皿中。混勻后，在室溫下放置5min即可。
4、吸盡培養(yǎng)基，用冰冷的PBS清洗細(xì)胞2次。
5、細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞于15ml離心管中（PBS依次為5ml，3ml和3ml）。預(yù)冷后2000rpm 5min收集細(xì)胞。
6、倒去上清。按照細(xì)胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得細(xì)胞終濃度為每200ul含2×106個(gè)細(xì)胞。這樣每100ul溶液含1×106個(gè)細(xì)胞。再加入蛋白酶抑制劑復(fù)合物。
假設(shè)MCF7長(zhǎng)滿板為5×106個(gè)細(xì)胞。本次細(xì)胞長(zhǎng)得約為80％。即為4×106個(gè)細(xì)胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。
將2管混在一起，共800ul。
7、超聲破碎：VCX750，25％功率，4.5S沖擊，9S間隙。共14次。當(dāng)然，如果實(shí)驗(yàn)室有Bioruptor這種神器的話那就輕松了。

（二）、除雜及抗體哺育。
8、超聲破碎結(jié)束后，10，000g 4度離心10min。去除不溶物質(zhì)。
留取300ul做實(shí)驗(yàn)，其余保存于－80度。
300ul中，100ul加抗體做為實(shí)驗(yàn)組；100ul不加抗體做為對(duì)照組；100ul加入4ul 5M NaCl （NaCl終濃度為0.2M），65度處理3h解交聯(lián)，跑電泳，檢測(cè)超聲破碎的效果。
9、在100ul的超聲破碎產(chǎn)物中，加入900ul ChIP Dilution Buffer和20ul的50×PIC。
再各加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。4度顛轉(zhuǎn)混勻1h。
10、1h后，在4度靜置10min沉淀，700rpm離心1min。
11、取上清。各留取20ul做為input。一管中加入1ul 抗體，另一管中則不加抗體。4度顛轉(zhuǎn)過夜。

（三）、檢驗(yàn)超聲破碎的效果。
取100ul超聲破碎后產(chǎn)物，加入4ul 5M NaCl，65度處理2h解交聯(lián)。分出一半用酚/氯仿抽提。電泳檢測(cè)超聲效果。

第二天：
（一）、免疫復(fù)合物的沉淀及清洗。
12、孵育過夜后，每管中加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。
4度顛轉(zhuǎn)2h。
13、4度靜置10min后，700rpm離心1min。除去上清。
14、依次用下列溶液清洗沉淀復(fù)合物。清洗的步驟：加入溶液，在4度顛轉(zhuǎn)10min，4度靜置10min沉淀，700rpm離心1min，除去上清。
洗滌溶液：a. low salt wash buffer----one wash
b. high salt wash buffer-----one wash
c. LiCl wash buffer------one wash
d. TE buffer------two wash
15、清洗完畢后，開始洗脫。洗脫液的配方：100ul 10％SDS， 100ul 1M NaHCO3， 800ul ddH2O，共1ml。
每管加入250ul洗脫buffer，室溫下顛轉(zhuǎn)15min，靜置離心后，收集上清。重復(fù)洗滌一次。最終的洗脫液為每管500ul。
16、解交聯(lián)：每管中加入20ul 5M NaCl（NaCl終濃度為0.2M）。
混勻，65度解交聯(lián)過夜。

第三天：
（一）、DNA樣品的回收
17、解交聯(lián)結(jié)束后，每管加入1ul RNaseA（MBI），37度孵育1h。
18、每管加入10ul 0.5M EDTA， 20ul 1M Tris.HCl（PH 6.5），2ul 10mg/ml 蛋白酶K。
45度處理2h。
19、DNA片段的回收―――omega膠回收試劑盒。最終的樣品溶于100ul ddH2O。

（二）、PCR分析

ChIP技術(shù)總結(jié)
（一）、關(guān)于細(xì)胞
細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)要好。因?yàn)榧?xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)直接影響細(xì)胞內(nèi)部的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，也很有可能影響你所研究的TF與其靶Promoter的結(jié)合。
一般細(xì)胞長(zhǎng)到75％－80％比較好。

（二）、關(guān)于抗體！
抗體是實(shí)驗(yàn)成敗的致命因素之一！必須是IP級(jí)別的抗體，另外如果經(jīng)濟(jì)條件許可的話，盡量買大廠的抗體。不推薦國(guó)產(chǎn)抗體和santa cruz的抗體，即使是IP級(jí)別的。
單抗與多抗的選擇也需要仔細(xì)考慮。兩種抗體各有利弊。單抗特異性強(qiáng)，背景低。但是單抗有一個(gè)致命的弱點(diǎn)，就是識(shí)別位點(diǎn)單一，而在ChIP甲醛交聯(lián)的過程中，很有可能該位點(diǎn)被其它蛋白或核酸結(jié)合而被封閉，導(dǎo)致單抗不能識(shí)別靶蛋白。多抗雖然沒有這個(gè)問題，但是多抗特異性較差，背景可能會(huì)偏高。
一般而言，如果沒有十足把握（單抗的識(shí)別位點(diǎn)遠(yuǎn)離靶蛋白與核酸結(jié)合的區(qū)域），選擇多抗比較穩(wěn)妥一些。

（三）、關(guān)于交聯(lián)與超聲破碎！
這一塊的確是ChIP實(shí)驗(yàn)中比較難把握的部分。交聯(lián)的程度會(huì)影響到超聲破碎的效果，交聯(lián)的程度越高，超聲破碎就越不易把基因組打碎成小片段。
交聯(lián)不充分，只有一部分靶蛋白與其Promoter相結(jié)合，富集得到的Promoter的量不高，實(shí)驗(yàn)假陰性。交聯(lián)過充分，基因組上結(jié)合了太多的蛋白，對(duì)超聲破碎造成障礙。另外也會(huì)增加背景。
一般來講，按照我的經(jīng)驗(yàn)，交聯(lián)條件取決于細(xì)胞類型。不同的細(xì)胞系，交聯(lián)的條件也不一樣。例如：NIH－3T3的交聯(lián)條件是室溫（25攝氏度）下15min，1％的甲醛濃度，而別的細(xì)胞系則可能完全不一樣。而超聲破碎的條件，機(jī)器不一樣，條件也不一樣。當(dāng)然如果你有bioruptor這樣的神器，那么超聲破碎對(duì)你而言就是小菜一碟了。
一般，理想的超聲破碎得到的片段大小是200bp－1000bp。但是200bp－2000bp的范圍也是可以接受的。

（四）、關(guān)于操作
希望盡可能的保持低溫（4度）。
沉淀的時(shí)候可以先在4度放置一會(huì)，等它自然沉降一些，再超低轉(zhuǎn)速（500rpm等）離心使其完全沉降。
雖然說明書上說ChIP實(shí)驗(yàn)的過程中有幾個(gè)可以停頓的地方，我還是希望你能夠連續(xù)把它做完，直到PCR結(jié)果出來為止。盡量避免實(shí)驗(yàn)中不可預(yù)知的影響因素。

（五）、關(guān)于解交聯(lián)
雖然說明書上說4小時(shí)已經(jīng)足夠，但是我還是希望你可以解交聯(lián)過夜。因?yàn)樵谀菢拥沫h(huán)境里，DNA不會(huì)降解，過夜解交聯(lián)更充分些。只是不要忘記在EP管口封上封口膜。
（六）、關(guān)于DNA片段的回收
需要注意的是：樣品中SDS樣品較高，普通的PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收，很有可能會(huì)在最終的樣品中混入SDS，影響PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
小Tip：過柱前，在樣品中加入一定量的異丙醇，能有效的消除SDS沉淀。