染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）技術(shù)

 

 

第一部分，什么是ChIP技術(shù)

 

1.1簡(jiǎn)介

染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（Chromatin Immunoprecipitation, ChIP）是一種檢測(cè)在體內(nèi)自然染色質(zhì)環(huán)境下蛋白和DNA相互作用的有效方法。這種技術(shù)廣泛應(yīng)用于檢測(cè)特定基因調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合在基因組中的具體位置或者基因調(diào)節(jié)區(qū)域和蛋白的修飾是否相關(guān)。。因其能真實(shí)、完整地反映結(jié)合在DNA序列上的靶蛋白的調(diào)控信息，是目前基于全基因組水平研究DNA-蛋白質(zhì)相互作用的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，日益成為研究真核細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄調(diào)控情況的重要途徑。

1.2技術(shù)原理

在活細(xì)胞狀態(tài)下，通過在特定時(shí)間點(diǎn)上用甲醛交聯(lián)等方式固定蛋白質(zhì)－DNA 復(fù)合物，相當(dāng)于這一時(shí)間點(diǎn)上細(xì)胞內(nèi)蛋白和DNA相互作用的關(guān)系被瞬時(shí)“快照（snapshot）”下來(lái)。并將其用Bioruptor超聲波破碎儀隨機(jī)超聲打斷為一定長(zhǎng)度的染色質(zhì)小片段，然后通過免疫學(xué)方法將蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物與特定DNA結(jié)合蛋白的抗體孵育，將與抗體特異結(jié)合的蛋白-DNA復(fù)合物洗脫下來(lái)，最后將洗脫得到的特異DNA與蛋白解交聯(lián)，得到特異性地富集目的蛋白結(jié)合的 DNA 片段，，，通過對(duì)DNA片斷的純化與檢測(cè)，從而獲得蛋白質(zhì)與 DNA 相互作用的信息。

1.3適用研究

1.31 篩選調(diào)控蛋白在基因組上的結(jié)合靶點(diǎn)：針對(duì)轉(zhuǎn)錄因子、DNA/RNA 聚合酶、轉(zhuǎn)錄復(fù)合物等調(diào)控因子蛋白進(jìn)行特異性的富集，分離純化與之結(jié)合的靶 DNA 片段并測(cè)序，分析篩選到準(zhǔn)確有效的靶位點(diǎn)、靶基因數(shù)據(jù)；

1.32 揭示差異化表觀遺傳變異的原理：通過對(duì)不同表型組織內(nèi)組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子蛋白及其他結(jié)合蛋白進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序并定量分析靶基因表達(dá)調(diào)控水平或針對(duì)同種組蛋白進(jìn)行甲基化、磷酸化、泛素化修飾所導(dǎo)致的結(jié)合位點(diǎn)變異進(jìn)行分析，即可準(zhǔn)確揭示差異化表觀變異原理；

1.33研究表觀遺傳變異疾?。航柚旧|(zhì)免疫共沉淀測(cè)序技術(shù)結(jié)合生物信息分析揭示由蛋白與 DNA 相互作用變異而引起的疾病的原理，明確表觀遺傳修飾在癌癥等表觀遺傳變異疾病的發(fā)生發(fā)展過程中的具體作用機(jī)制。

 

 

 

 

第二部分，ChIP實(shí)驗(yàn)具體如何操作

 

ChIP實(shí)驗(yàn)可用于研究植物動(dòng)物微生物，對(duì)于動(dòng)物樣品有的是組織塊（比如腫瘤樣品），有的是黏附細(xì)胞或者懸浮細(xì)胞，根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)對(duì)象ChIP實(shí)驗(yàn)的步驟流程和復(fù)雜程度會(huì)有些不同，大致上是相同的。我們可以用最常用的相對(duì)簡(jiǎn)單的動(dòng)物黏附細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象闡述一下具體實(shí)驗(yàn)方法。

 

2.1甲醛交聯(lián)細(xì)胞

(1)細(xì)胞在100mm培養(yǎng)皿上生長(zhǎng)到80% ~90%。當(dāng)?shù)谝淮问褂眉?xì)胞系做實(shí)驗(yàn)時(shí)，另外培養(yǎng)兩個(gè)培養(yǎng)皿，一個(gè)用于預(yù)測(cè)細(xì)胞數(shù)量，另外一個(gè)用于優(yōu)化超聲條件。
(2)去除上清培養(yǎng)液，加入lOmL 1xPBS含有終濃度為1%甲醛（加入270μL 37%甲醛到10 mL PBS)固定交聯(lián)細(xì)胞，輕柔混合后置于室溫10 ~20 min。
(3)加入1 mL 1.25mol/L甘氨酸（終濃度為0.125 mol/L)終止交聯(lián)反應(yīng)，甘氨酸終止甲醛的固定作用是通過提供過量的氨基團(tuán)與甲醛結(jié)合。繼續(xù)放在室溫5 min。
注意：從這一步開始，把所有東西放在冰上或者4℃,包括離心步驟。
(4)吸取走上清液后，用10 mL預(yù)冷1xPBS洗兩遍后，以去除殘留的甲醛。
(5)加入4 ~5mL預(yù)冷1xPBS，能足夠覆蓋培養(yǎng)皿的表面，再用細(xì)胞刮棒刮落細(xì)胞, 轉(zhuǎn)移到50 ml錐形離心管，再用4~5 mL預(yù)冷1 xPBS沖洗培養(yǎng)皿以收集殘留的細(xì)胞。
(6)4000 rpm 離心 5 min (4℃)。
(7)去除上清，用1 mL預(yù)冷1xPBS (新鮮加入1xPIC 1O μL)懸浮細(xì)胞后，轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管。
(8)4000 rpm 離心5 min (4℃)得到細(xì)胞沉淀，去除上清（細(xì)胞沉淀可放于 -80 ℃冰箱保存）。

2.2染色質(zhì)超聲斷裂

(1) 加入1 mLSDS裂解溶液重懸沉淀（新鮮加入1 X PIC 1O μl,在冰上放置10 min,每隔1 min顛倒搖動(dòng)離心管。SDS能裂解細(xì)胞膜和核膜，使固定染色質(zhì)釋放出來(lái)， 這樣有利于超聲。
(2) 用公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)化儀器Bioruptor超聲儀把DNA打碎為長(zhǎng)度在200 ~ 1000 bp,把樣品放在冰上操作。不同細(xì)胞樣本都得進(jìn)行超聲條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。
(3) 在超聲后，14000 rpm 離心 10 min(4℃)，轉(zhuǎn)移超聲染色質(zhì)液體上清到1.5 ml 離心管。上清液可放于-80℃冰箱保存。

2.3免疫沉淀蛋白和DNA復(fù)合物

(1)使用ChIP稀釋溶液把超聲染色質(zhì)液體稀釋10倍，這樣有利于免疫沉淀反應(yīng)。 例如200 μL超聲染色質(zhì)液體加入1800 μL ChIP稀釋溶液（新鮮加入1 x PIC 20 μL)。
(2)為了減少非特異性結(jié)合蛋白背景，往2 mL超聲稀釋液中加入20 μL蛋白A/G瓊脂糖珠（Protein A/G Agarose Beads),在4℃搖床輕柔搖動(dòng)1 h。
(3)1000 rpm離心2 min (4℃），轉(zhuǎn)移上清液到新的離心管，加入1〜4叫免疫沉淀抗體（每種抗體加入的量都不同）到上清液中，在4℃搖床輕柔搖動(dòng)過夜。另外取 50 μL上清液，不加入抗體，作為陰性對(duì)照，以驗(yàn)證檢測(cè)的特性。

2.4收獲免疫復(fù)合物（抗體-蛋白質(zhì)-DNA)

(1) 40 μL Protein A/G Agarose Beads 先用 1 mL 1 x PBS 洗 3 遍，每次洗后 1 000 rpm 離心1 min,小心吸除上清，注意不要吸走Beads。最后加40 μL 1XPBS懸浮Beads。
(2)打開樣品的管蓋，加入40 μL Protein A/G Agarose Beads。在搖床上面搖動(dòng)1~2 h，4℃，以形成抗體-蛋白A免疫復(fù)合物。
(3)1000 rpm離心5min,4℃。去除上清，注意不要吸走Beads。
(4)清洗Beads:免疫沉淀復(fù)合物依次用以下所列的緩沖液洗（每個(gè)1 mL)。每次洗時(shí)，使樣品在搖床上面10min，4℃，然后再4000 rpm離心5 min。吸取上清時(shí)要注意不要吸走beads。
a.低鹽洗脫溶液1 mL洗一次；
b.高鹽洗脫溶液1 mL洗一次；
c.氯化鋰洗脫溶液1 mL洗一次；
d.TE溶液（pH 8.0) 1 mL洗兩次。

2.5洗脫免疫復(fù)合物

注意：從這一步開始，所有操作都在室溫進(jìn)行。

(1)加入200 μL ChIP洗脫溶液洗脫Beads，放在搖床上室溫?fù)u動(dòng)10 min。12000 rpm，離心1 min,把上清轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管。
(2)再加入200 μL ChIP洗脫溶液洗脫Beads,放在搖床上室溫?fù)u動(dòng)10 min，一共洗脫3次，得到600 μL洗脫液。洗脫液中含有目的蛋白以及其結(jié)合的相關(guān)DNA。

2.6去除甲醛交聯(lián)

(1)加入 24μL 5mol/L NaCl 到 600μL 樣品中（NaCl 終濃度為 0.2mol/L)，包括 上述1.3中的50 μL陰性對(duì)照（加入350μL ChIP洗脫溶液和16 μL 5mol/L NaCl)。
(2)65℃，過夜去除甲醛交聯(lián)。甲醛能夠在有鹽離子和去污劑的高溫環(huán)境下解除交聯(lián)反應(yīng)，使得蛋白質(zhì)和DNA分離。

2.7 DNA 純化

DNA純化可以通過酚/氯仿抽提或者通過硅膠柱純化。
酚/氯仿抽提
(1)對(duì)所有實(shí)驗(yàn)樣本（600 μL)和50μL 陰性對(duì)照樣本，分別加入 10μg RNase A， 在37℃放置30min，以去除RNA。然后加入50μg 蛋白酶K，在37℃放置1h。
(2)加入等體積酚/氯仿/異戊醇（25:24:1)，混勻，12000 rpm 離心5 min。
(3)小心吸取上清液到新的1.5 mL離心管，加入 1/10體積的3 mol/L 乙酸鈉和2倍體積冰凍無(wú)水乙醇，順時(shí)針混勻后，放在-80℃冰箱1h。
(4)12000 rpm 離心 20 min，4℃。
(5)小心去除上清，注意不要吸走DNA沉淀，然后再加入70%乙醇，懸浮沉淀，12000 rpm離心10min，去除上清，讓DNA沉淀干燥。
(6)用40 μL TE溶解DNA沉淀。

2.8染色質(zhì)免疫沉淀DNA的分析和蛋白質(zhì)在DNA上結(jié)合位點(diǎn)的鑒定

(1)如果目的蛋白的靶序列是已知的或者懷疑某個(gè)序列是目的蛋白的靶序列，可以根據(jù)靶序列設(shè)計(jì)引物，用熒光定量PCR的方法，比較特異性和非特異性免疫抗體所沉淀的DNA的PCR產(chǎn)物的量，或者比較根據(jù)靶序列設(shè)計(jì)的引物和遠(yuǎn)離靶序列設(shè)計(jì)的引物的PCR產(chǎn)物的量。比值越大，則說明靶序列DNA與目的蛋白相結(jié)合的可能性越大。
(2)如果目的蛋白的靶序列未知或者高通量研究目的蛋白在基因組的分布情況，找出轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，可以采用DNA芯片（ChIP-chip)和ChIP-seq方法。

 

 

 

第三部分 目的DNA如何進(jìn)行檢測(cè)

 

3.1實(shí)時(shí)定量 PCR

用比較精確的實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)沉淀的DNA樣品，稱為實(shí)時(shí)定量染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（qChIP）。這種方法是在體內(nèi)確定DNA和蛋白質(zhì)相互作用。與ChIP-on-Chip方法相比，成本低廉。目前實(shí)時(shí)定量染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（qChIP）已經(jīng)開始應(yīng)用于分析減數(shù)分裂時(shí)期蛋白質(zhì)和DNA相互作用的研究。

3.2染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序（ChIP-SEQ ）

為了在基因組范圍內(nèi)重新發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，需進(jìn)一步確定染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)得到的DNA樣品的序列。 其序列可以通過直接測(cè)序確定，這種方法稱為染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序（ChIP-SEQ）。ChIP-SEQ 為巨大的DNA并行序列應(yīng)用快速進(jìn)化平臺(tái)，以高分辨率確定樣品中富集的基因組區(qū)域。 目前，Illumina Genome Analyzer（GA）技術(shù)頻繁用于染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序（ChIP-SEQ ）應(yīng)用的平臺(tái)。其它針對(duì)高通量測(cè)序的平臺(tái)是 Helicos HeliScope 和 ABI SOL- iD。

3.3 ChIP-on-chip

ChIP-on-chip是將染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）和DNA微陣列芯片技術(shù)相結(jié)合用來(lái)高通量分析DNA和蛋白質(zhì)結(jié)合或者翻譯后染色質(zhì)/組蛋白修飾的一種方法。 該技術(shù)已經(jīng)成為深入研究?jī)?nèi)源蛋白和DNA相互作用的有力工具。因該技術(shù)能在基因組范圍內(nèi)確定轉(zhuǎn)錄因子或組蛋白修飾所在位置的染色質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)，故也被稱為全基因組定位分析 （genome-wide location analysis，GWLS）。

該技術(shù)是將染色質(zhì)免疫共沉淀與包含整個(gè)基因組或特定目的區(qū)域的芯片聯(lián)合使用，大規(guī)模地迅速確定生理?xiàng)l件下特定轉(zhuǎn)錄因子在染色體上的結(jié)合位點(diǎn)。具體方法是：將經(jīng)過染色質(zhì)免疫共沉淀的DNA樣品純化后進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 然后用熒光素標(biāo)記（如 Cy3）。對(duì)沒有經(jīng)過免疫沉淀反應(yīng)富集的 Input DNA 樣品也進(jìn)行擴(kuò)增，并且用另一種熒光素標(biāo)記（如 Cy5），作為結(jié)合背景的參照。之后將這兩種 DNA 雜交于包括基因組序列的微陣列芯片上，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的靶序列用每個(gè)點(diǎn)相應(yīng)的熒光強(qiáng)度來(lái)確定。樣品準(zhǔn)備是影響ChIP-on- chip 結(jié)果的一個(gè)重要因素。目前常用的是覆瓦式芯片（tiling arrays），該芯片包含完全非重復(fù)性基因組。由于ChIP-on-chip 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)量大，問題復(fù)雜，所以下游的生物信息學(xué)分析相當(dāng)重要 。 Toedling 等人應(yīng)用免費(fèi)和公開的資源 R package Ringo，使 ChIP-on-chip 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析更便利。這個(gè)軟件能提供循環(huán)數(shù)據(jù)輸入功能，質(zhì)量評(píng)價(jià)，標(biāo)準(zhǔn)化和形象化數(shù)據(jù)，檢測(cè)ChIP富集的基因組區(qū)域。

ChIP -on -chip 擴(kuò)展了染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)技術(shù)的應(yīng)用范圍，可以用于基因組功能的研究，能夠繪制基因順式調(diào)控區(qū)域和核小體位置及修飾的細(xì)節(jié)，完善 真核生物的序列。這種方法首次應(yīng)用在釀酒酵母的研究上，之后被應(yīng)用于人細(xì)胞的研究。在醫(yī)學(xué)方面，已經(jīng)應(yīng)用“ChIP-on-chip” 技術(shù)確定了骨細(xì)胞的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)錄機(jī)制?？傊?，ChIP-on-chip已經(jīng)成為一種在基因組范圍內(nèi)研究蛋白質(zhì)和DNA相互作用及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的常用方法。 隨著各個(gè)物種基因組覆瓦式芯片陸續(xù)發(fā)布，全基因組定位分析技術(shù)的應(yīng)用將會(huì)越來(lái)越廣泛。

 

 

 

3.2-3染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序（ChIP-SEQ）和ChIP-on-chip技術(shù)的比較

ChIP是相對(duì)成熟的技術(shù)，但目前還存在一些技術(shù)難點(diǎn)。例如，ChIP實(shí)驗(yàn)涉及的步驟多，結(jié)果的重復(fù)性較低，需要大量的起始材料；染色質(zhì)免疫沉淀獲得的DNA數(shù)量往往很多，包含大量的非特異結(jié)合的假陽(yáng)性結(jié)合序列；而對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞和干細(xì)胞等，往往培養(yǎng)困難，并且難以區(qū)分個(gè)別細(xì)胞與總體細(xì)胞的表型。在此背景下，配合使用芯片或者第二代高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)這些DNA片段，就形成了ChIP-chip技術(shù)和ChIP-Seq技術(shù)。
      ChIP-Seq是將深度測(cè)序技術(shù)與ChIP實(shí)驗(yàn)相結(jié)合分析全基因組范圍內(nèi)DNA結(jié)合蛋白結(jié)合位點(diǎn)、組蛋白修飾、核小體定位或DNA甲基化的高通量方法，可以應(yīng)用到任何基因組序列已知的物種，并能確切得到每一個(gè)片段的序列信息。相對(duì)于ChIP-chip技術(shù)，ChIP-Seq是一種無(wú)偏向檢測(cè)技術(shù)，能夠完整顯示ChIP富集DNA所包含的信息。ChIP-chip技術(shù)的缺點(diǎn)在于它是一個(gè)“封閉系統(tǒng)”，只能檢測(cè)有限的已知序列信息，相比之下，ChIP-Seq的優(yōu)勢(shì)在于其強(qiáng)大的“開放性”，強(qiáng)大的發(fā)現(xiàn)和尋找未知信息的能力。因此，ChIP-Seq與傳統(tǒng)的ChIP-chip技術(shù)相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)：
  （1） 靈敏度很高。傳統(tǒng)的ChIP-chip實(shí)驗(yàn)要求起始DNA的量在4ug以上，而一般ChIP-Seq實(shí)驗(yàn)對(duì)起始DNA量的要求是10ng。這直接反映在起始細(xì)胞數(shù)目的減少，對(duì)于像早期胚胎發(fā)育相關(guān)的研究中更占優(yōu)勢(shì)。
  （2） 靈活性很強(qiáng)。ChIP-chip實(shí)驗(yàn)以研究對(duì)象的特定物種的全基因組DNA芯片平臺(tái)為基礎(chǔ)，所以不適合應(yīng)用在那些基因組序列信息不豐富或缺少相關(guān)芯片平臺(tái)開發(fā)的物種。ChIP-Seq技術(shù)則不存在這方面的限制，可以應(yīng)用到任何基因組序列已知的物種，并能確切得到每一個(gè)片段的序列信息。
  （3） 分辨率極高。傳統(tǒng)的微陣列芯片技術(shù)受制于當(dāng)前芯片的容量，事實(shí)上不能涵蓋真正的全基因組DNA序列信息，這導(dǎo)致ChIP-chip的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分辨率不高，精確定位蛋白與DNA的結(jié)合位點(diǎn)存在一定的困難。而ChIP-Seq技術(shù)輔之以強(qiáng)大的生物信息計(jì)算能力，可以高效地將測(cè)序得到的序列定位到特定基因組的精確堿基位置上，分辨率大大提升。
  （4） 不具備其它一些芯片相關(guān)的負(fù)效應(yīng)，如由核酸非特異雜交帶來(lái)的噪音信號(hào)。
      因此，隨著目前測(cè)序的成本不斷降低及通量迅速增高等優(yōu)勢(shì)，ChIP-Seq已經(jīng)基本上取代ChIP-chip成為研究轉(zhuǎn)錄因子、RNA聚合酶、核小體等DNA結(jié)合蛋白體內(nèi)結(jié)合靶點(diǎn)的主打技術(shù)。

3.21ChIP-Seq實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的關(guān)鍵主要有以下幾個(gè)方面：
1， 抗體質(zhì)量：一個(gè)靈敏度高和特異性高的抗體可以得到富集的DNA片段，這有利于探測(cè)結(jié)合位點(diǎn)。
2， 空白對(duì)照：空白對(duì)照是必要的，存在很多假陽(yáng)性情況需要通過空白對(duì)照進(jìn)行判斷。一般來(lái)說有三種類型的空白對(duì)照：      

(1) 部分進(jìn)行免疫沉淀前的DNA（input DNA），這是最常用的；

(2) 由免疫共沉淀得到而不含有抗體的DNA（mock IP DNA），使用這個(gè)的問題在于收集到的量可能不夠；

(3) 使用非特異免疫共沉淀方法得到的DNA。
3， 測(cè)序深度：在發(fā)表的ChIP-Seq實(shí)驗(yàn)中，一般使用Illumina Genome Analyzer上的一個(gè)lane產(chǎn)生的數(shù)據(jù)作為一個(gè)基本單位，目前一個(gè)lane大概是8-15 million reads。判斷足夠的測(cè)序深度的標(biāo)準(zhǔn)是：當(dāng)增加測(cè)序得到更多的reads時(shí)不能發(fā)現(xiàn)更多的東西。將這一標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用到結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量上就是：進(jìn)行測(cè)序，增加reads數(shù)而無(wú)法得到更多的結(jié)合位點(diǎn)。
4， Multiplexing：對(duì)于基因組比較小的物種（E.coli, C.elegans）來(lái)說，一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的illumina lane得到的數(shù)據(jù)太多了，僅僅測(cè)一個(gè)樣本比較浪費(fèi)，所以可以將多個(gè)樣本加不同的adapter放在一起測(cè)。
      由于現(xiàn)在提供高通量測(cè)序的服務(wù)商很多，大家只需要把經(jīng)ChIP富集得到的DNA樣品純化好交給測(cè)序公司就可以了。但是大家經(jīng)常會(huì)遇到測(cè)序結(jié)果信號(hào)弱，背景高等令人頭疼的問題，其實(shí)ChIP-Seq除了找一家專業(yè)的測(cè)序服務(wù)提供商以外，更重要的是如何獲取更高質(zhì)量的ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
      常見的兩種ChIP實(shí)驗(yàn)技術(shù)有N-ChIP和X-ChIP技術(shù)。N-ChIP采用核酸酶消化染色質(zhì)，適用于研究DNA與高結(jié)合力蛋白的相互作用，比如組蛋白修飾等方面的研究；X-ChIP則采用甲醛或紫外線進(jìn)行DNA和蛋白交聯(lián)，通過超聲波片段化染色質(zhì)，適合用來(lái)研究DNA與低結(jié)合力蛋白的相互作用問題，例如大多數(shù)非組蛋白方面的蛋白研究。
      破碎DNA及具有較高的特異性和親和力的抗體是ChIP實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵因素。大多數(shù)的ChIP實(shí)驗(yàn)都使用超聲的方法打斷DNA，最理想的情況是將DNA打斷成200-1000bp的彌散片段，而不同類型及不同數(shù)量的細(xì)胞對(duì)超聲的條件都不一樣，這往往導(dǎo)致超聲的結(jié)果無(wú)法重復(fù)，因此，超聲要根據(jù)細(xì)胞類型和數(shù)量對(duì)條件進(jìn)行摸索，將最佳超聲條件固定下來(lái)，以保持實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。

 

 

第四部分ChIP實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵因素有哪些

 

4.1 甲醛的固定交聯(lián)程度

  甲醛能使蛋白質(zhì)和DNA固定交聯(lián)形成復(fù)合物，能夠真實(shí)反映細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和DNA相互作用情況。最好使用新鮮的甲醛，注意甲醛是否已經(jīng)過了有效期。剛開始進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)時(shí)，甲醛固定的時(shí)間要進(jìn)行優(yōu)化。甲醛固定的時(shí)間太長(zhǎng)，雖然會(huì)得到更多的蛋白質(zhì)和DNA交聯(lián)復(fù)合物，但是需要更多時(shí)間進(jìn)行超聲打碎，使得樣品溶液過熱導(dǎo)致蛋白質(zhì)和DNA變性。另外，過度固定交聯(lián)，會(huì)使目的蛋內(nèi)的抗原決定簇被屏蔽，不能和抗體結(jié)合有效結(jié)合，而引起免疫沉淀下降。甲醛固定的時(shí)間如果太短的話，蛋白質(zhì)和DNA形成的復(fù)合物交聯(lián)不牢固，很容易在超聲時(shí)分離，可能在離心步驟時(shí)引起丟失。因此要對(duì)甲醛的固定時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，一般的時(shí)間為10~20 min。

4.2 超聲打碎染色質(zhì)樣本所獲得的DNA片段大小

  用于染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的最佳DNA片段要求在超聲后為200 ~1000 bp。獲得恰當(dāng)大小的DNA片段關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成敗以及對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的解釋。因此要重視超聲條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。根據(jù)不同細(xì)胞類型和細(xì)胞濃度，選擇不同的超聲時(shí)間和超聲次數(shù)。最初ChIP實(shí)驗(yàn)使用普通的金屬探頭式超聲儀，超聲時(shí)要把超聲針頭插入到接近離心管底部的地方，一般離底部5~10 mm,且不要碰到管壁。樣本要放在冰上進(jìn)行操作，以免超聲時(shí)樣品過熱而使蛋白和DNA變性。目前大家普遍使用ChIP實(shí)驗(yàn)超聲神器Bioruptor非接觸式超聲波破碎儀，由于Bioruptor超聲儀一次可以處理多個(gè)密閉樣品管進(jìn)行超聲處理，樣品間不存在交叉污染，超聲能量穩(wěn)定一致，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性大大提高，徹底地完美解決了超聲問題。

4.3 抗體能否識(shí)別和免疫沉淀目的蛋白的有效性

  目的蛋白抗體有效性也是染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵因素。要選擇高質(zhì)量,高親和力和高效價(jià)的抗體來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。先做Western Blot來(lái)檢驗(yàn)在染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)條件下抗體是否能夠和目的蛋白的抗原決定簇結(jié)合而免疫沉淀。當(dāng)抗體不能有效識(shí)別交聯(lián)中的目的蛋白時(shí)，可更換其他不同靶向抗原決定簇的抗體或者降低甲醛固定交聯(lián)時(shí)間。

 

第五部分 超聲打斷為何推薦要使用Bioruptor超聲波破碎儀

 

比利時(shí)Diagenode生產(chǎn)的Bioruptor plus非接觸式細(xì)胞破碎儀，其超聲源是一塊附著在水槽下面的半導(dǎo)體金屬塊，絕非普通的壓電陶瓷。其獨(dú)特的ACT( Adaptive Cavitation Technology) 聚焦超聲技術(shù)以及高效的超聲效能，能快速處理各種樣品，得到滿意的超聲結(jié)果。

 

 

儀器標(biāo)配1.5ml適配器（如上圖），可同時(shí)處理6個(gè)樣本，適配器中每個(gè)樣本的填裝體積以及濃度，更是針對(duì)ChIP或ChIP-seq技術(shù)特別優(yōu)化過的，與實(shí)驗(yàn)室所需的上樣量與上樣濃度完全銜接，符合實(shí)驗(yàn)室需求。

自帶電磁閥式冷循環(huán)機(jī)，與超聲儀主機(jī)交錯(cuò)啟動(dòng)，可保證在處理測(cè)序DNA或chromatin樣本片斷化時(shí)，讓樣本處于恒定冰冷水浴條件下，同時(shí)完全不干擾超聲波傳到到樣本的效率，其高性價(jià)比、高通量、高功率、低干擾的優(yōu)異設(shè)計(jì)，都是為了讓實(shí)驗(yàn)的結(jié)果更精準(zhǔn)、更正確、重復(fù)性更佳。

此外更考慮到實(shí)驗(yàn)與應(yīng)用的多元性，廠家特別設(shè)計(jì)出適合極小量樣本的0.65ml適配器，一次可以處理12個(gè)樣本，是市面上能處理體積最小的適配器，完全是讓珍貴樣本也能進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn)特別訂制的，也徹底解決了無(wú)法處理微量珍貴樣品進(jìn)行ChIP或測(cè)序?qū)嶒?yàn)的困境。

Diagenode廠家提供了各種實(shí)驗(yàn)的方案技巧，可以官網(wǎng)免費(fèi)下載，或者聯(lián)系代理商獲取，減少因?yàn)槊鞒晽l件而浪費(fèi)了得之不易的樣本。

儀器還含有自動(dòng)過熱斷電保護(hù)及儀器壽命監(jiān)控系統(tǒng)，可確保儀器在操作過程中的正常運(yùn)作以及保護(hù)測(cè)序樣本不過熱產(chǎn)生質(zhì)變的危險(xiǎn)，可讓儀器正常使用情況可超聲效率維持長(zhǎng)久不衰減。